Önceki bölüm:  CRISPR-Cas9 Metodu-2 : Kargolama ve Tamir Mekanizması

Önceki bölümlerde bahsettiğimiz gibi CRISPR-Cas9’ u hücreye aktarıp çalıştırdığımızda, DNA’da istediğimiz bölgede ikili kırık oluşacak. Daha sonra hücre, iki tamir mekanizmasından birini kullanarak tamir edecek. HR yolunda homolog kromozomdan tabiri caizse kopya çekerek kırık bölgeyi yeniden oluştururken NHUB yolunda uçlardan bir kısım nükleotidlerin kaybını göze alarak direkt uçları birbirine kaynaştırıyor.

Aslında, hangi yolu isteyeceğimiz bizim gen üzerindeki çalışmamıza bağlı. Eğer genin fonksiyon kaybını istiyorsak(bkz. Gen nakavt), hücreyi direkt olarak NHUB’a yönlendirmek en mantıklısı. Böylece nükleotid kaybıyla gen dizisi bozulacak ve büyük olasılıkla anlamsız, yanlış anlamlı veya çerçeve kayması(eğer kaybolan nükleotid sayısı 3’ün katları değilse) mutasyonlarından biri meydana gelecek(Resim-1b). Şurada bir parantez açarak

söylemeliyim ki eğer ortamda o anda kırık uçlarla eşleşecek DNA parçaları varsa, random bir insersiyon da gerçekleşebilir, ancak bu da yine gen inaktivasyonuna sebep olacaktır. Sonuçta, gen ürünümüz yani proteinimiz artık fonksiyonel olmayacağından, bu proteinin işlevini gözlemleyebileceğiz. Diyelim ki bir genin fonksiyonunu öğrenmek istiyoruz. NHUB sonucunda varsayımsal bir A proteinin fosforilasyonu azaldıysa, hedef genin bu A proteinin fosforilasyonunu doğrudan ve ya dolaylı olarak arttırdığını söyleyebiliriz. Dahası, bu yolla hastalıkları tedavi edebiliriz. Eğer hücrede mutant bir protein varsa ve bunun eski fonksiyonunu kazanması yerine hücrede hiç bulunmaması daha avantajlıysa, bu geni  NHUB yoluyla bozabilir ve böylece hücrenin hastalığa sebep olan proteinden kurtulmasını sağlayabiliriz (gen inaktivasyonu).

HR yolunda ise yapılan ise tasarladığımız kalıp DNA’yı hücreye vermek. Böylece, kalıp DNA’ yı nasıl tasarladıysak, gen bölgesini o şekilde değiştirebileceğiz. Mesela alıcının genomuna bir gen eklemek istiyoruz. Önce bu gen homolog kromozoma, kalıp DNA, ekleniyor ve daha sonra alıcı hücreye CRISPR-Cas9 sistemi ile birlikte veriliyor. Böylece, bu geni alıcının genomuna dahil edebiliyoruz. Örneğin, oldukça popüler bir protein olan yeşil floresan proteini(GFP) genini( normalde Aequoria victoria türü denizanasında bulunur) farelere CRISPR-Cas9 ile ekleyip yeşil ışık yaymalarını sağlayabiliriz( Resim-2). Ya da daha pratik uygulamalara bakalım. İnsan hücreleri için gerekli bir protein geninin eksikliğinden kaynaklı ölümcül bir hastalık düşünelim. Eğer, bu hastalığı embriyo döneminde teşhis edersek, CRISPR teknolojisi ile bu genin  hücrelere ekleyebiliriz ve böylece o insanın yaşamasını sağlarız. Muhteşem değil mi?

Ya da, silinmiş bir geni eklemek yerine, hastalığa sebep olan mutant bir geni yabani tip(wild-type) versiyonuna dönüştürebiliriz. Tek yapmamız gereken aynı şekilde uygun CRISPR-Cas9’u ve yabani tip alleli taşıyan kalıp kromozomu hücreye vermek. Sonrasını siz de tahmin ediyorsunuzdur ancak yine de tekrar edelim. Önce, cas proteini gRNA’nın kendisini gösterdiği yeri, yani hedef gen bölgesini kesecek. Ardından, hücre bu kırığı bizim verdiğimiz ve yabani tip alleli taşıyan kromozoma bakarak düzeltecek. Böylece, mesela varsayımsal bir lokus için aa genotipli bir bireyi Aa yapıp fenotipini değiştirebiliriz. Burada son aşamaya dikkatinizi çekmek istiyorum. Hücre nasıl oluyor da kırığı kendi “a” homolog kromozomuna bakarak değil de, bizim dışarıdan verdiğimiz “A”  kromozomuna bakarak tamir ediyor? Dahası, önceki yazılarda da bahsetmiştik, memeli hücrelerinde NHUB yolu çok daha yaygın. Nasıl bir yol izlemeliyiz ki hücreyi hem HR yoluna hem de HR’de bizim dışarıdan verdiğimiz kromozomu kullanmaya itelim?

Öncelikle, memeli hücrelerinin neden NHUB yolunu daha sık kullandıklarına bakalım. Bunun aslında pratik bir sebebi var. Homolog kromozomlar sadece S ve G2 fazlarında kullanıma açık olacağından, HR yolunun sadece bu fazlarda kullanılabilir. Yani, hücrenin elinin altında her zaman hazır bir homolog kromozom yok.  Ancak NHUB için böyle bir sınırlama yok, hücre her hangi bir anda bu yolu kullanabilir. Çekirdeğin içinde diğer homolog kromozomun bulunması nispeten daha uzun süreli ve muhtemelen de daha çok enerji gerektiren bir süreç. Oldukça mantıklı bir diğer sebep ise, memelilerin genom içeriğiyle alakalı. Memeli genomunun büyük bir içeriğini tekrar eden diziler oluşturuyor. Benzer dizilerden fazlaca bulunması, hücrenin HR yolunda yanlış bir bölgeyi kalıp kullanmasına sebep olabilir. NHUB yolu ise bir birine çok yakın, muhtemelen az önce kırılmış iki ucu bir araya getirmede rol oynuyor. NHUB yolunun HR yolunu baskılaması ve hücre içinde daha hızlı gerçekleşmesi ise NHUB’un bu kadar sık görülmesinin diğer sebepleri olarak sayılabilir³.

Hücrenin NHUB yolunu seçmek için böyle sebepleri var ancak biz dışarıdan müdahale ile HR yolunun gerçekleşme ihtimalini arttırabiliriz. Eğer, tasarladığımız kalıp kromozomdan onbinlerce kopyayı hücreye verirsek, HR yolunu uyarabiliriz. Homolog kromozom artık kolayca ulaşılabilir olduğundan, HR yolunun ihtimali artacaktır. Aynı zamanda, tasarlanan kromozomdan onbinlerce verdiğimizden, HR yolunda hücre kendisindeki homolog kromozoma erişmekte zorlanacak (bir tane olduğu için) ve dışarıdan verilen kalıbı kullanacaktır. Yapabileceğimiz diğer bir metod, hücrede NHUB yolunun gerçekleşmesini engellemektir. Araştırmacılar, bu yolda gerekli olan bir Ligaz proteinini inhibe ettiler ve bunun sonucunda HR yolunun daha çok gerçekleştiği gözlendi⁴. Diğer bir araştırmada ise,  HR yolu ile ilişkili bir proteinin stimulasyonu, HR frekansını arttırdı.⁵ HR yolunu inhibe eden ve uyaran proteinler üzerine çalışmalar umut verici ve gelecekte oldukça popüler olacağa benziyor.

CRISPR-Cas9 sisteminin kökeninden, nasıl hücreye yerleştireceğimizden, dezavantajlarından ve bunları nasıl avantaja dönüştüreceğimizden bahsettik. Ne tesadüftür ki tam da CRISPR hakkında yazmayı planladığım  sıralarda, 2020 Nobel ödülleri açıklandı. Kimya dalında ise CRISPR sisteminin ökaryotlardaki kullanımı üzerine öncü çalışmalarından dolayı Emmanuelle Charpentier ve Jennifer Doudna kazanan oldu.Çalışmaları hakkında detaylı linki Kaynak kısmına bırakıyorum⁶. Her şeyi hesaba kattığımızda, Gen düzenleme, özellikle CRISPR aracılı gen düzenleme gelecekte biyoteknolojinin ve gen terapisinin en gözde konusu olacak gibi duruyor.

Kaynaklar ve İleri Okuma

[1] King, D. The CRISPR/Cas9 System and its Applications [Internet] Cell Culture

Dish 16 May 2016. Available from:

https://cellculturedish.com/the-crispr-cas9-system-and-its-applications/

[2] retrieved from:

[3] Yang H, Ren S, Yu S, Pan H, Li T, Ge S, Zhang J, Xia N. Methods Favoring Homology-Directed Repair Choice in Response to CRISPR/Cas9 Induced-Double Strand Breaks. International Journal of Molecular Sciences. 2020; 21(18):6461.

[4] Improving CRISPR-induced homologous recombination. Nat Methods 12, 388 (2015). https://doi.org/10.1038/nmeth.3375

[5] Nambiar, T.S., Billon, P., Diedenhofen, G. et al. Stimulation of CRISPR-mediated homology-directed repair by an engineered RAD18 variant. Nat Commun 10, 3395 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-11105-z

[6] https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/press-release/

Dünya genelinde en yaygın görülen kanser olan akciğer kanseri, her yıl 2 milyondan fazla insanı hayattan koparıyor. Araştırmacılar “Cycloartobiloxanthone” adlı flavonoid’i (bir çeşit bitkisel molekül grubu diyelim) ağaç kabuklarından izole etti ve akciğer kanser hücreleri üzerinden apoptoz’u yani hücre ölümünü uyardığı bulundu. Akciğer kanseri tedavisinde yeni bir dönem başlatabilecek bu makaleyi okul projesi olarak ingilizce sundum. Aşağıdaki linkten izleyebilirsiniz.

NOT: Çok hızlı konuştuğumu biliyorum, makaleyi 10 dk. içinde özetlememiz gerekiyordu. Bu hıza rağmen 12 dk. da anlatabilmişim…

Önceki bölüm–> CRISPR-Cas9 Metodu-1: Genetikte Yeni Çağ

Cas-9 proteini ve hedefe göre tasarlanan gRNA’yı hücreye koyup çalışmasını sağlarsak, bu istediğimiz DNA bölgesini kesebileceğimiz anlamına gelir. Peki kesince ne olacak? DNA’da ikili kırık oluşturmak nasıl olur da genleri istediğimiz şekilde değiştirir? Şimdi bu dahice tasarlanan sürece daha yakından bakalım.

Paketin Teslimatı

İlgili genimizi belirledik. CRISPR sistemi için gerekli bileşenleri topladık. Sırada, CRISPR sistemini bir şekilde hücremize dahil edip onu çalıştırmak var.Bir ökaryotik hücreye CRISPR-Cas9 sistemini yüklemenin 3 farklı yolu var: vektör aracılı teslimat, direkt kompleks teslimatı ve RNA teslimatı (Şekil-1).

DNA yolunda, hücreye uygun bir ekspresyon vektörü seçilip buna cas operonu ve gRNA’yı kodlayacak DNA parçası ekleniyor. Daha sonra bu vektör hücreye veriliyor ve çekirdekte ekspresyonu gerçekleşiyor. Transkripsiyon sonucunda oluşan cas-9 mRNA’ları translasyonla proteinleri oluşturuyor. Oluşan cas-9’lar, gRNA’lar ile kompleks oluşturuyor ve gRNA nereyi gösterirse DNA’da o bölge iki zincirden kesiliyor. mRNA ve Protein yollarının DNA yolundan tek farkı ise ilk aşamaları atlamamız: mRNA yolunda direkt sentezlenmiş RNA’lar, protein yolunda ise sentezlenip gRNA ile son halini alan cas-9’ lar hücreye veriliyor(Şekil-1).

Peki, çift zincir kırıklarını oluşturduk. DNA’ ya böyle bir ciddi bir çift kırık hasarı vermenin bize nasıl bir faydası olabilir ki? Bu kırıklar, tek bir kromozomda oluşan bir kırık bile hücrenin ölümüne sebep olabilir¹.İşte, güzel kısım burada, yine hücrenin normalde zaten sahip olduğu bir sistemi dahice kendi faydamıza kullanıyoruz: DNA ikili zincir kırık tamiri.

DNA Kırık Tamirleri

Şimdi, CRISPR’a biraz ara verip moleküler biyoloji bilgilerimizi tazeleyelim. İonize radyasyon, radyoaktif kimyasallar veya mekanik stres kromozomlarda kırıklara sebep olabilir². Ökaryotik hücreler, kromozomlarında bir ikili zincir kırığı tespit ettiklerinde, bunu iki şekilde tamir edebilirler: Homolog rekombinasyon veya Non-homolog uç bağlanması.

Non-Homolog Uç Bağlama(NHUB) Yolu

Bu yolda, hücre kırık uçları işleyerek tekrar ligasyon yapar(Şekil-2). Non-homolog denmesinin sebebi ise homolog rekombinasyon yolunun aksine, bu yolda kırık kromozomun homologu kalıp olarak kullanılmaz. Hücre iki ucu direkt ligasyon yapar. Ancak, bu yolun dezavantajı ise çoğu zaman hücre ortamında kırık uçlar tam olarak birbirine uyumlu kalmaz ve uçlardan bir kısım nükleotidlerin kaybı gerekir. Yani NHUB yolunda önce uçlardan bir kısım nükleotidler koparılıyor ve daha sonra kırık uçlar birleştiriliyor. Ancak biz biliyoruz ki tek bir nükleotid değişimi bile çok büyük hasarlara sebep olabiliyor (bkz. Orak hücreli anemi). Görünen o ki, bir DNA kırığının hücreye zararı çok daha fazla ve hücre zincir tamiri sebebiyle oluşan nükleotid kayıplarından kaynaklanacak problemleri göze alıyor.

Homolog Rekombinasyon (HR) Yolu

HR yolunda da hücre kırık uçları kısaltıyor ancak, bu kayıplar homolog kromozoma bakılarak tekrar sentezleniyor(Şekil-2). Homolog kromozomoun kalıp olarak kullanılması sayesinde, Non-homolog rekombinasyon aksine, hücrede gen fonksiyonunun kaybı ihtimali düşüyor. Ancak bu yolun muhtemel  dezavantajlarından biri ise heterozigotluk kaybı. Bu şu demek; rastgele bir kromozomdaki rastgele bir gen lokusu için “Aa” heterozigot bir birey düşünelim. “A” allelini taşıyan kromozom lokusunda bir kırık oluşur ve hücre bu kırığı HR ile tamir ederse, kalıp olarak “a” allelini kullanacağı için, büyük ihtimalle baskın allel de “a”ya dönüşecek. İşte bir heterozigot bireyin homozigot bireye dönüşmesine heterozigotluk kaybı deniyor ve HR, bunun sebeplerinden biri.

Sebebini kesin olarak bilmiyoruz ancak memeli hücrelerinde NHUB yolu çok daha yaygın olarak gerçekleşiyor⁴. Bunun mantıklı bir sebebi ise, homolog kromozomlar sadece S ve G2 fazlarında kullanıma açık olacağından, HR yolunun sadece bu fazlarda kullanılması. Ancak NHUB için böyle bir sınırlama yok, hücrede her hangi bir anda kullanılabilir.

Peki biz bu tamir mekanizmalarını CRISPR-Cas9 sisteminde nasıl kullanacağız? Bu soruyu size bırakıyorum, bir sonraki yazıda cevabı öğreneceğiz.

Üçüncü bölümde, CRISPR-Cas9 sisteminde bu tamir mekanizmalarını kullanarak nasıl gen susturma, tamir ve fonksiyon kazanma gerçekleştirildiği incelenecek.

Kaynaklar ve İleri Okuma

[1] Featherstone, C., Jackson, S.P. DNA double-strand break repair

 [Internet] Elsevier. 21 October 1999. Available from:

https://www.cell.com/current-biology/comments/S0960-9822(00)80005-6

[2] Stephen P. Jackson, Sensing and repairing DNA double-strand breaks, Carcinogenesis, Volume 23, Issue 5, May 2002, Pages 687–696, Available from:

https://doi.org/10.1093/carcin/23.5.687

[3] Finkelstein, I. How do DNA repair proteins initiate double-strand breaks repair?[Internet] [ cited 15 January 2021]. Available from:

http://finkelsteinlab.net/research

[4] Davis AJ, Chen DJ. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2013 Jun;2(3):130-143. doi: 10.3978/j.issn.2218-676X.2013.04.02. PMID: 24000320; PMCID: PMC3758668.

2013 yılında, Feng Zhang ve arkadaşları tarafından Science dergisinde bir makale yayınlandı¹. O zamanlar bilim dünyasında çığır açan bu makale, CRISPR/Cas adı verilen metodun ökaryotlardaki muhtemel uygulamaları üzerineydi. Bu sistemle, genleri kesebilir, istediğimiz parçaları ekleyebilir ve bu sayede birçok hastalığı tedavi edebilirdik.

Nedir bu dillerden düşmeyen CRISPR? Sokaktan geçen vatandaşlara sorsak, çoğunun duymuş olduğu, oldukça popüler bir konsept. Metodun bilim dünyasındaki etkisini, CRISPR yayınlarının 2013 ve sonrasındaki dramatik artışından da anlayabiliriz( Res-1).

Biyolojide, devrim niteliğindeki çoğu buluşta olduğu gibi (bkz. RNAi), burada da yapılan şey, doğada zaten bulunan bir sistemi alıp bunu amacımıza göre tasarlayarak kullanmaktan ibaret.

CRISPR SİSTEMİNİN KÖKENİ: PROKARYOTLAR

CRISPR, “kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar” ın baş harflerine karşılık geliyor. Bakteriler ve arkelerin genomlarında bulunan bu tekrarlar, aslında kendilerini enfekte eden bakteriyofajların DNA parçaları. Bakteriler, bu parçalara bakarak, bir daha o virus saldırdığında, onu tanıyıp genetik materyalini yok ediyor³. Bir nevi fajlara karşı bağışıklık sistemi: Kaydet, Hazırlan, Saldır.

Moleküler Mekanizma: Doğada Nasıl Çalışıyor?

Cas, “CRISPR ilişkili diziler”in kısaltması. Hücrenin DNA’sında, bu operonlar, her birinin ayrı fonksiyonu olan cas proteinlerini üretiyor. Bakteri yeni bir fajla tanışınca, cas1-cas2 protein kompleksi, faj DNA’sının bir bölümünü bakteri kromozomuna entegre ediyor (Resim-2). Bakteri, çeşitli fajlardan topladığı bu parçaları(CRISPR dediğimiz sekanslar bunlar) kendi genomunda belli aralıklarla arka arkaya dizip, toplu bir şekilde transkribe ediyor. Bu transkript(pre-crRNA), daha sonra aynı şekilde küçük parçalar(crispr RNA’lar,crRNA) şeklinde işleniyor ve her crRNA, tracrRNA(trans aktivatör crispr RNA,Resim-2’de crRNA’lara bağlı tokalar şeklinde resmedilmiş) adlı başka bir tip RNA parçasıyla birleşip cas-9 proteini ile bir araya geliyor. Buradan sonra hücre, faj DNA’sı için pusuya yatıyor diyebiliriz. Faj DNA’sı bakteriye girdiğinde, eğer crRNA-DNA eşleşmesi meydana gelirse, cas-9 faj DNA’sını yıkıyor (Resim-3). TracrRNA ise katalitik süreci kolaylaştırmaktan sorumlu. TracrRNA+crRNA’ ya ise gRNA(rehberRNA) deniyor. Bu sistem sayesinde bakteri,önceden karşıılaştığı bir fajın saldırısını savuşturabiliyor.

Peki bilim adamları bu süreçte neyi farketti? 4.aşamaya tekrar bakalım (Resim-3). Cas-9, crRNA’nın eşleşme yaptığı DNA’yı iki zincirden kesiyor. Eğer biz değiştirmek istediğimiz genin RNA’sını crRNA olarak cas-9’ la birlikte hücreye sunabilirsek, cas9-crRNA kompleksi hücrenin içinde o geni bulup kesebilir mi?

İşte bilim insanları da bunu sordu. Cevabı ikinci bölümde…

Kaynaklar ve İleri Okuma

[1] Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3. PMID: 23287718; PMCID: PMC3795411.  Arşiv linki için:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23287718/

[2] Harnessing the potential of gene editing technology using CRISPR in inflammatory bowel disease – Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/Number-of-CRISPR-publications-by-year_fig1_333091003 [accessed 10 Jan 2021]

[3] Barrangou,R. (2015). “The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond”. Current Opinion in Immunology. 32: 36–41. doi:10.1016/j.coi.2014.12.008. PMID 25574773.

[4] https://www.bio-rad.com/en-tr/applications-technologies/crispr-cas-gene-editing-teaching-resources?ID=Q58I0DWDLBV5  ‘den alındı.